厚生労働科学研究費補助金（難治性疾患克服研究事業）「Menkes病・occipital horn症候群の実態調査、早期診断基準確立、治療法開発に関する研究」平成22年度 総括・分担研究報告書（page 28/94）[厚生労働科学研究費補助金（難治性疾患克服研究事業）「Menkes病・occipital horn症候群の実態調査、早期診断基準確立、治療法開発に関する研究」平成22年度 総括・分担研究報告書]

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概要：
平成22年度厚生労働科学研究費補助金(難治性疾患克服研究事業)研究報告書研究課題:「Menkes病患者皮膚線維芽細胞のLOX活性に対するDiethylthilcarbamate(DEDTC)の効果の検討」分担研究者藤澤千恵(帝京大学小児科・Re....

平成22年度厚生労働科学研究費補助金(難治性疾患克服研究事業)研究報告書研究課題:「Menkes病患者皮膚線維芽細胞のLOX活性に対するDiethylthilcarbamate(DEDTC)の効果の検討」分担研究者藤澤千恵(帝京大学小児科・Research Fellow)研究報告研究要旨今回、ヒト線維芽細胞を用いてdisulfiramの細胞に対する効果を検討した。Menkes病患者皮膚線維芽細胞及び正常皮膚線維芽細胞に銅とdisulfiramを添加、培養上清中のlysyl oxidase活性を測定した。その結果、disulfiram添加によりlysyl oxidaseの活性が上昇した。このことより、disulfiramは細胞内に蓄積した銅酵素を分泌、活性化する可能性が示唆された。A.研究目的oxidase活性はBCAにより測定した細胞タンパクMenkes病患者皮膚線維芽細胞はATP7A機能不全質あたりで換算を行った。により細胞内に銅を蓄積し、細胞内から銅が分泌(3)銅濃度測定されない。また、銅酵素であるlysyl oxidsase回収した細胞溶液を用いて銅濃度測定を行っも同様に細胞内から細胞外へと分泌されないたた。細胞を1mlDDWで混濁、超音波処理した。細め、患者ではlysyl oxidase活性が低下する。本胞溶液500??lに濃硝酸150 ?lを添加、濃縮乾固、研究ではdisulfiramにより細胞内に蓄積した銅2N硝酸1mlを添加、測定溶液とした。測定溶液はを細胞外へ輸送すると仮定し、lysyl oxidase活日立Z-2100にて測定を行った。性の測定を行った。(4)患者データTable 1に患者データを示す。B.研究方法(1)皮膚線維芽細胞培養帝京大学ですでに採取、培養した後保存した皮膚線維芽細胞を10%FBS添加DMEM培地にて80%confluentとなるまで培養を行った。80 %confluentの細胞は50 ?g/ml ascorbic acid含有phenol red free DMEMにDEDTC 0.2 ?Mを添加及び無添加で48時間培養した。培養上清はlysyloxidase assayに使用した。(2)lysyl oxidase assay培養上清750??lにassay buffer 1,250??l( 0.05 M sodium borate pH8.2, 1.2M Urea C.研究結果1,5-diaminopentane 10mM, Amplex Red 10mM, Menkes病患者線維芽細胞及び正常ヒト線維芽with /without BAPN 500 mM)を添加、Ex 463 nm,細胞培養上清中lysyl oxidase活性の測定を行っEm 483 nmで測定を行った。各細胞上清中lysylた。Menkes病患者は銅を有効に取り込めないこと26